Gracias por visitar nature.com.Está utilizando una versión de navegador con soporte limitado para CSS.Para obtener la mejor experiencia, le recomendamos que utilice un navegador más actualizado (o desactive el modo de compatibilidad en Internet Explorer).Mientras tanto, para garantizar un soporte continuo, mostramos el sitio sin estilos ni JavaScript.Control deslizante con tres artículos mostrados por diapositiva.Use los botones Anterior y Siguiente para navegar por las diapositivas o los botones del controlador de diapositivas al final para navegar por cada diapositiva.Xi Jiang, Lucía Payá-Tormo, … Luis Manuel RubioMin-Hyung Ryu, Jing Zhang, … Christopher A. VoigtRyoma Tsujimoto, Hiroya Kotani, … Yuichi FujitaKuo-En Chen, Hui-Yu Chen, … Yi-Fang TsayAndriele Wairich, Ben Hur Neves de Oliveira, … Janette Palma FettBenedict M. Long, Wei Yih Hee, … G. Dean PriceMatthew J. Milner, Stéphanie M. Swarbreck, … Emma J. WallingtonMaoxing Zhang, Yin Wang, … Yiyong ZhuHan Yang, Yafei Li, … Zhukuan ChengBiología de las comunicaciones volumen 5, Número de artículo: 1006 (2022) Citar este artículoLa ingeniería de cereales para expresar nitrogenasa funcional es un objetivo a largo plazo de la biotecnología vegetal y permitiría el reemplazo parcial o total de los fertilizantes nitrogenados sintéticos mediante la metabolización del N2 atmosférico.El desarrollo de esta tecnología se ve obstaculizado por la complejidad genética y bioquímica de la biosíntesis de nitrogenasa.La nitrogenasa y muchas de las proteínas accesorias involucradas en su ensamblaje y función son sensibles al O2 y solo escasamente solubles en huéspedes no nativos.Generamos plantas de arroz transgénicas que expresan el componente estructural de la nitrogenasa, la proteína Fe (NifH), que lleva un grupo [4Fe-4S] en su forma activa.NifH de Hydrogenobacter thermophilus se dirigió a las mitocondrias junto con la supuesta peptidil prolil cis-trans isomerasa NifM de Azotobacter vinelandii para ayudar en el plegamiento del polipéptido NifH.El NifH aislado fue parcialmente activo en la transferencia de electrones al componente nitrogenasa de la proteína MoFe (NifDK) y en la biosíntesis del cofactor hierro-molibdeno de la nitrogenasa (FeMo-co), dos funciones fundamentales de NifH en la fijación de N2.Sin embargo, la funcionalidad de NifH estaba limitada por la ocupación deficiente del grupo [4Fe-4S], lo que destaca la importancia de la inserción y la estabilidad del grupo [Fe-S] in vivo para lograr la fijación biológica de N2 en la planta.Sin embargo, la expresión y la actividad de un componente de nitrogenasa en plantas de arroz representa el primer gran paso para diseñar nitrogenasa funcional en cultivos de cereales.Los cultivos utilizan nitrógeno (N) principalmente en dos formas diferentes: nitrato (NO3–) y amonio (NH4+).El N es uno de los principales componentes de la clorofila, los compuestos de transferencia de energía como el ATP, los ácidos nucleicos y las proteínas.Por lo tanto, la disponibilidad de N en los cultivos controla la tasa de fotosíntesis, el crecimiento celular, el metabolismo y la síntesis de proteínas1.Los cultivos dependen de un suministro adecuado de N, generalmente obtenido de fertilizantes sintéticos industriales, pero no asimilan más de la mitad del N aplicado como fertilizante, y el resto se derrama o se filtra del suelo como una fuente importante de contaminación2,3,4 .Por lo tanto, es importante explorar estrategias que reduzcan la dependencia de la agricultura de los fertilizantes nitrogenados.La fijación biológica de nitrógeno (FBN) es la reducción del gas N2 a amoníaco (NH3) por la enzima nitrogenasa5.El BNF está muy extendido en procariotas (bacterias y arqueas), pero aún no se conoce ninguna especie de eucariota que convierta directamente el N2 en una forma biológicamente útil6.La transferencia directa de genes de nitrogenasa de procariotas a cultivos es una de las estrategias más ambiciosas para lograr BNF en plantas7,8.Las nitrogenasas están compuestas por dos metaloproteínas interactuantes sensibles al O2: la dinitrogenasa y la dinitrogenasa reductasa5.En la nitrogenasa de molibdeno (Mo), que es la forma más abundante y mejor caracterizada, estos componentes se conocen como proteína MoFe (codificada por nifD y nifK) y proteína Fe (codificada por nifH), respectivamente.Además, se requieren múltiples componentes accesorios para el ensamblaje y la actividad de la nitrogenasa9.La proteína MoFe (NifD2K2) incluye dos grupos P [8Fe-7S] y dos cofactores FeMo [homocitrato 7Fe-9S-C-Mo-R], y su función es unir y reducir N2.La proteína Fe es un homodímero de NifH que presenta un solo grupo [4Fe-4S] que une las dos subunidades y un sitio para la unión e hidrólisis de MgATP en cada subunidad10.La proteína Fe es el donante obligado de electrones de la proteína MoFe para la reducción de N211.También se requiere para la maduración y activación del grupo P de la proteína MoFe y FeMo-co9.Debido a que la proteína Fe es más sensible al O2 que la proteína MoFe, y debido a que también se requiere para la biosíntesis de los cofactores de la proteína MoFe, su expresión funcional se ha utilizado como prueba de principio para la ingeniería de nitrogenasa en eucariotas12.Las mitocondrias y los cloroplastos son orgánulos de conversión de energía en las células eucariotas con la capacidad de proporcionar electrones de bajo potencial y ATP necesarios para BNF.El ambiente bajo en O2 de las mitocondrias también protege a la nitrogenasa del daño por O212.Ambos orgánulos, por lo tanto, han sido probados para la expresión de la proteína nitrogenasa Fe12,13,14,15.La proteína Fe activa se produjo expresando NifH y NifM como el complemento mínimo, opcionalmente junto con NifS y NifU dependiendo de la biosíntesis e inserción del grupo [Fe-S] por parte de la especie huésped.NifM es una supuesta peptidil prolil cis-trans isomerasa que facilita el plegamiento de la proteína Fe y mejora su solubilidad16,17.NifS moviliza S de la cisteína para la síntesis de grupos [Fe-S] en NifU, que posteriormente los dona a la proteína apo-Fe sin grupos18,19.Cuando NifH y NifM se coexpresaron en las mitocondrias de la levadura Saccharomyces cerevisiae, NifU y NifS no fueron necesarios porque la maquinaria biosintética del grupo [Fe-S] mitocondrial pudo cargar grupos [4Fe-4S] en la proteína apo-NifH eficientemente12.Sin embargo, cuando NifH se coexpresó transitoriamente con NifM, NifS y NifU en las mitocondrias de Nicotiana benthamiana, la actividad de la nitrogenasa fue menor que la alcanzada en la levadura, lo que sugiere que el éxito de la inserción del grupo [4Fe-4S] depende en última instancia de la [Fe -S] maquinaria de racimo del host15.Aquí, diseñamos arroz para expresar genes nifH y nifM seleccionados, dirigiendo las proteínas correspondientes a la matriz mitocondrial para minimizar el daño por O2 y producir NifH correctamente plegado y enzimáticamente activo.Los polipéptidos NifH solubles acumulados en las mitocondrias de arroz y la proteína Fe aislada mostraron una funcionalidad limitada en la donación de electrones a la proteína MoFe y en la síntesis de FeMo-co, dos actividades fundamentales para diseñar la nitrogenasa.La transferencia in vitro de grupos [4Fe-4S] del donante NifU a NifH fue necesaria para lograr la máxima actividad de la proteína Fe.Este resultado indica que a pesar de que NifH incorporó algunos grupos [4Fe-4S] mitocondriales de arroz endógenos que conducen a la actividad, gran parte de ellos se acumularon como apoproteínas, lo que identificó la biosíntesis, la inserción y la estabilidad de los grupos [Fe-S] como áreas que deberían ser las más importantes. foco de futuras investigaciones.Los genes que codifican Hydrogenobacter thermophilus NifH (NifHHt) y Azotobacter vinelandii NifM (NifMAv) se clonaron en vectores separados y se introdujeron en arroz junto con el gen de la higromicina fosfotransferasa (hpt) para la selección.Las secuencias nifHHt y nifMAv se optimizaron previamente por codones para S. cerevisiae y se expresaron tanto en S. cerevisiae como en N. benthamiana15.Se usaron las mismas secuencias nifHHt y nifMAv con codones optimizados porque no había codones raros presentes en los dos genes en el contexto del uso de codones de arroz20.La expresión del gen nifHHt fue impulsada por el fuerte promotor de ubiquitina de maíz constitutivo y el primer intrón (ZmUbi1 + 1sti).El péptido de tránsito mitocondrial de 29 aminoácidos N-terminal de la subunidad IV (Cox4) de la citocromo c oxidasa de S. cerevisiae se agregó a la secuencia de codificación, en base a trabajos previos que muestran su capacidad para dirigir GFP a las mitocondrias de arroz21.También se agregó la etiqueta Twinstrep (TS) de 28 aminoácidos para facilitar la detección y purificación de NifHHt.Esta etiqueta no afectó la actividad de NifH en A. vinelandii, S. cerevisiae o N. benthamiana14,15.Se construyó un vector de ADN auxiliar para coexpresar nifMAv bajo el control del promotor constitutivo OsActin.En este caso, se utilizó un péptido de tránsito N-terminal de la subunidad 9 (Su9) de Neurospora crassa porque se demostró que entrega GFP a las mitocondrias de arroz21 y NifM a las mitocondrias de N. benthamiana15.El proceso para la recuperación de callos de arroz transgénicos que expresan transgenes nif y la regeneración de plantas transgénicas se muestra en la Fig. 1 complementaria.La expresión de OsNifHHt y OsNifMAv se analizó en los niveles de ARNm y proteína en tres líneas independientes de callos de arroz y las plantas regeneradas correspondientes (Fig. 1 y Fig. 2 complementaria).Ambos genes se expresaron en niveles más altos en las plantas que en el callo (Fig. 1a, b).El gen nifHHt se colocó bajo un promotor más fuerte que nifMAv porque el primero codifica la proteína Nif más abundante y es parte del complejo nitrogenasa.Aunque no hay ningún estudio que demuestre que NifM es esencial para NifH en las mitocondrias de las plantas, se ha demostrado que NifM es necesario para la solubilidad de NifH en sistemas de expresión heterólogos que incluyen E. coli, mitocondrias de levadura y cloroplastos de plantas14,16,22.Aunque no pudimos obtener señales claras de Western blot para OsNifMAv en los extractos de plantas, el hecho de que OsNifHHt fuera soluble indicó que OsNifMAv se expresó en niveles suficientes para facilitar la maduración del polipéptido NifH, como se demostró recientemente para NifHHt en S. cerevisiae22.En los callos, tanto OsNifHHt como OsNifMAv dieron lugar a bandas del tamaño esperado (~33 kDa para ambas proteínas) cuando se analizaron mediante SDS-PAGE y western blot, lo que indica que las proteínas se procesaron correctamente y fueron estables en las mitocondrias de arroz (Fig. 1c, d).El análisis de la expresión de la proteína OsNifHHt en la generación T1 confirmó que OsNifHHt se heredó de manera estable y se expresó en la progenie (Fig. 1e, f).Niveles relativos de expresión de ARNm de OsnifHHt y OsnifMAv en tres líneas de plantas de arroz diferentes (replicas biológicas independientes) (a) y las líneas de callos correspondientes (b).Los datos (normalizados a ARNm de OsActin) son medias ± SD (n = 3 repeticiones técnicas).Análisis de inmunotransferencia de extractos de proteínas solubles de hojas de arroz (c) y callos (d) probados con anticuerpos contra NifH, NifM y Strep-tag.Se usaron anticuerpos contra RuBisCO como control de carga para líneas de plantas.La tinción de Ponceau se utilizó como control de carga para los extractos de callos debido a la baja expresión de RuBisCO.El carril Ctrl muestra callos y líneas de plantas no transformados.e Expresión estable de OsNifHHt en la generación segregante T1 de la línea de plantas de arroz HtH200.Se usó extracto de proteína de callo que expresa OsNifHHt (línea HtH206) como control positivo (Pos ctrl).Las inmunotransferencias sin recortar se muestran en las Figs. complementarias.6–10.f Fenotipo de la progenie T1 que expresa OsNifHHt que muestra un crecimiento y desarrollo normales.OsNifHHt se purificó a partir de callos de arroz y las plantas regeneradas correspondientes mediante cromatografía de afinidad con etiqueta de estreptococos (STAC) (Fig. 2a, b; Fig. 3 complementaria).Para minimizar la exposición al O2 producido durante la fotosíntesis y maximizar el aislamiento de OsNifHHt funcional, las plantas se fertilizaron con Fe y se cosecharon antes del inicio de la luz al final del período de oscuridad, siguiendo un procedimiento previamente demostrado para obtener NifHAv y NifHHt activos del tabaco. cloroplastos y mitocondrias15,23.El OsNifHHt purificado era principalmente soluble y podía aislarse de la línea de plantas Ht200 con rendimientos de 0,5 mg kg-1 de peso fresco (plantas de 1 mes) o 0,25 mg kg-1 de peso fresco (plantas de 2 meses).El rendimiento de OsNifHHt de tres líneas de callos independientes fue de ~2,5 mg kg−1 (línea Ht189), ~7 mg kg−1 (línea Ht200) y ~6,5 mg kg−1 (línea Ht202) (Fig. 4 complementaria).OsNifHHt purificado de callos y plantas migró como una sola banda principal que indica un procesamiento correcto (Fig. 2a, b).La comparación lado a lado de ScNifHHt y OsNifHHt (ambos dirigidos a las mitocondrias) también fue consistente con el procesamiento correcto de OsNifHHt en la matriz mitocondrial del arroz, lo que resultó en proteínas con pesos moleculares de ~ 33 kDa (Fig. 2c).La secuenciación N-terminal de OsNifHHt purificado reveló un producto principal con los residuos N-terminales anticipados QKP después de la escisión del péptido Cox4, junto con tres variantes menores que representan eventos de procesamiento alternativos (Fig. 2d).La espectrometría de masas identificó la proteína OsNifHHt con una cobertura de secuencia del 63 % y confirmó que el extremo C de la proteína estaba intacto (Fig. 5 complementaria).a Purificación de OsNifHHt del callo Ht189.Las fracciones se analizaron mediante SDS-PAGE seguido de tinción con Coomassie o inmunotransferencia.Extracto total TE, extracto libre de células soluble CFE, fracción de flujo continuo FT, fracción de lavado W, fracción de elución E.Fracción de elución concentrada Econc (muestra final recogida).se corta exposición, le larga exposición.El análisis de inmunotransferencia no recortado para los procesos de purificación se muestra en la Fig. 11 complementaria. b Muestra final de OsNifHHt aislada de líneas de callos Ht200 y Ht202, y plantas de arroz Ht200.Los geles de Coomassie no recortados y el análisis de inmunotransferencia para los procesos de purificación se muestran en la Fig. 3 complementaria. c Comparación lado a lado de la migración de NifHHt cuando se aísla del callo Ht189 (OsNifHHt) o levadura (ScNifHHt).d Secuenciación N-terminal de OsNifHHt aislado del callo Ht189.Los sitios de procesamiento del péptido dirigido mitocondrial Cox4 deducidos se indican con flechas (el tamaño de procesamiento dominante se indica con una flecha más grande).Las secuencias subrayadas indican conectores peptídicos entre la señal Cox4 y la etiqueta TS (SAASA), y entre la etiqueta TS y OsNifHHt (SS).La actividad de la proteína Fe de OsNifHHt purificado se determinó in vitro utilizando un ensayo de reducción de acetileno después de mezclar con NifDK purificado de A. vinelandii (NifDKAv).La proteína OsNifHHt aislada de las hojas de arroz mostró baja actividad (~7 nmol de etileno min-1 mg-1 NifDKAv) (Fig. 3a), probablemente limitada por el rendimiento relativamente bajo de NifH en el tejido de la planta y, por lo tanto, la baja cantidad de NifH ( ~8,9 µg) y una proporción baja de NifH:NifDK (~10:1) en el ensayo.Para confirmar la funcionalidad de la proteína Fe de arroz aislada, realizamos experimentos de titulación utilizando cantidades crecientes de OsNifHHt purificadas de tres líneas de callos independientes.Como se anticipó para una proteína de Fe funcional, se observó una mayor actividad con una proporción creciente de NifH: NifDK (Fig. 3b).Es importante destacar que la actividad de la proteína OsNifHHt aislada de las hojas de arroz fue aproximadamente la mitad de la proteína del callo en una proporción similar, lo que puede reflejar el uso de proteína OsNifHHt vegetal más diluida en el ensayo (generalmente observamos una ligera inhibición causada por grandes cantidades de buffer).un ARA que usa OsNifHHt aislado de plantas de arroz HtH200 (proporción 10:1 de OsNifHHt:NifDKAv) (los datos son medias ± DE, n = 2 réplicas técnicas).La línea punteada indica el control negativo ARA en ausencia de NifH (media de n = 3 repeticiones técnicas).El ARA de control positivo (proporción 40:1 de NifHAv:NifDKAv) generó 1285 ± 225 unidades (media ± DE, n = 3 repeticiones técnicas).b ARA con cantidades crecientes de OsNifHHt aisladas de tres líneas diferentes de callos de arroz (proporción 0, 5:1, 10:1 y 20:1 de OsNifHHt:NifDKAv).El ARA de control positivo (proporción 20:1 de NifHAv:NifDKAv) generó 1426 ± 43 unidades para Ht189, 1127 ± 65 unidades para Ht200 y 1074 ± 153 unidades para Ht202 (los datos son medias ± SD, n = 3 repeticiones técnicas).c ARA usando OsNifHHt aislado de tres líneas diferentes de callos de arroz en una proporción de 40:1 de OsNifHHt:NifDKAv.El control positivo ARA (proporción 40:1 de NifHAv:NifDKAv) generó 1285 ± 225 unidades (los datos son medias ± DE, n = 3 repeticiones técnicas).d ARA usando OsNifHHt y ScNifHHt antes y después de la reconstitución con [4Fe-4S] EcNifUAv cargado en grupo.El control positivo ARA (usando NifHAv) generó 1553 ± 82 unidades.Todas las reacciones se realizaron con una proporción de 20:1 de NifH:NifDKAv (los datos son medias ± DE, n = 2 réplicas técnicas).Todas las actividades se informan como nmol de etileno formado por minuto y mg de NifDKAv.OsNifHHt parecía completamente soluble en las tres líneas de callos (Fig. 2a, Fig. 3a, b complementaria), a pesar del nivel de expresión variable de NifM (Fig. 1b, d).Las actividades de estas tres proteínas OsNifHHt en el mismo experimento con la misma relación NifH:NifDK de 40:1 fueron casi idénticas (Fig. 3c).Esto indicó que la expresión de OsNifMAv fue suficiente en las tres líneas de arroz, lo que concuerda con los resultados recientes obtenidos en S. cerevisiae22.Luego complementamos la mezcla de reacción con A. vinelandii NifU pura expresada en Escherichia coli y cargada con grupos [4Fe-4S] (EcNifUAv).Se sabe que NifU actúa como donante de [4Fe-4S] para apo-NifH in vivo24 e in vitro19.De hecho, la reconstitución de OsNifHHt mediante la transferencia in vitro de [4Fe-4S] de NifU aumentó su actividad ~ 9 veces (compare las actividades en la Fig. 3c, d).Es importante destacar que la actividad de las proteínas OsNifHHt y ScNifHHt fue idéntica después de la reconstitución (Fig. 3d), lo que sugiere que OsNifHHt se plegó correctamente pero no maduró por completo, probablemente debido a una inserción insuficiente del grupo [4Fe-4S] en OsNifHHt en la mitocondria del arroz. o quizás debido a la inestabilidad de los grupos como se sugirió previamente en N. benthamiana15.Estos resultados demuestran que las actividades del arroz reconstituido y la proteína Fe de levadura son comparables.El OsNifHHt aislado también apoyó la síntesis in vitro de FeMo-co, que es otro papel fundamental de NifH requerido para BNF.La síntesis de FeMo-co y la activación de apo-NifDKAv (que contiene grupos P pero carece de FeMo-co) se midió in vitro combinando Methanothermobacter thermautotrophicus NifB expresado en levadura (ScNifBMt), EcNifUAv (proveedor de grupos [4Fe-4S] para biosíntesis de NifB-co), S-adenosil metionina (SAM), molibdato, homocitrato, apo-NifENAv (aislado de una cepa ΔnifB que contiene grupos [4Fe-4S] permanentes pero que carece del precursor de FeMo-co), OsNifHHt purificado y apo-NifDKAv .El ensayo de síntesis de FeMo-co in vitro se puede dividir en tres pasos9.En el primer paso, la síntesis de NifB-co es catalizada por NifB, que transporta tres grupos [4Fe-4S] proporcionados por NifU25,26.Esta enzima radical SAM fusiona dos de sus grupos [4Fe-4S], incorpora un sulfuro adicional y genera un átomo de carburo que se inserta en el centro de este marco de Fe-S.El resultado es un [8Fe-9S-C] llamado NifB-co que luego se transfiere al andamio NifEN para servir como precursor de FeMo-co.En este paso, es probable que los grupos de NifU [4Fe-4S] utilizados como sustratos para NifB activen parte de la proteína OsNifHHt sin grupos.En el segundo paso, la maduración de FeMo-co ocurre en NifEN tras la incorporación de Mo y homocitrato, que dependen de asociaciones transitorias de NifH-NifEN27,28,29,30.El FeMo-co sintetizado de novo se transfiere a apo-NifDK, convirtiendo la proteína inactiva en holo-NifDK activa.En el tercer paso, ARA se usa a menudo para evaluar el nivel de actividad de holo-NifDK (y, por lo tanto, la síntesis de FeMo-co).Después de las reacciones de síntesis e inserción de FeMo-co, se añadió tetratiomolibdato para evitar una mayor incorporación de FeMo-co en apo-NifDKAv durante el ensayo de reducción de acetileno.OsNifHHt y ScNifBMt catalizaron conjuntamente la síntesis dependiente de NifB de FeMo-co in vitro.La síntesis de FeMo-co confirmó la compatibilidad de OsNifHHt y ScNifBMt como lo demuestra la maduración in vitro de NifDK (Fig. 4).También demostró la compatibilidad entre especies de OsNifHHt, ScNifBMt, NifENAv y NifDKAv, estableciendo colectivamente el núcleo bioquímico conservado de la nitrogenasa.La síntesis de FeMo-co in vitro se realizó combinando M. thermautotrophicus NifB purificado de levadura (ScNifBMt) con OsNifHHt (barra 1).El ARA subsiguiente se realizó usando una proporción molar de 20:1 de NifHAv a NifDKAv.Para inhibir la activación de apo-NifDKAv por FeMo-co producido durante el ARA, se añadió tetratiomolibdato a todos los viales después de la síntesis de FeMo-co in vitro y la inserción en apo-NifDKAv.La barra 2 representa la actividad de fondo observada al usar ScNifBMt en ausencia de OsNifHHt.Como reacciones de control para la funcionalidad de apo-NifENAv y apo-NifDKAv, se realizó la síntesis de FeMo-co usando ScNifHHt en presencia (Pos ctrl) o ausencia (Neg ctrl) de NifB-co purificado.Los datos son medias ± SD, n = 3 (barras 1 y 2) y n = 2 (barras 3 y 4) réplicas técnicas.La ingeniería de BNF en plantas es un objetivo importante de larga data de la biotecnología vegetal.Las estrategias anteriores para reducir la dependencia global de los fertilizantes nitrogenados incluían el uso de bacterias diazotróficas para colonizar la rizosfera31,32,33,34,35,36.La introducción de genes nif bacterianos en cereales para aumentar la productividad de los cultivos ofrece un enfoque más directo en el que las plantas fijan su propio N. La tecnología de transferencia multigénica permite optimizar diferentes combinaciones de genes heterólogos de diversos orígenes, así como elementos reguladores como promotores y péptidos dirigidos.Sin embargo, los desafíos restantes incluyen la sensibilidad al O2 de la nitrogenasa y sus proteínas accesorias, la complejidad de la maquinaria que proporciona grupos de metales a los componentes de la nitrogenasa9 y la compleja regulación de la expresión y actividad de la nitrogenasa37.Muchos genes nif están involucrados en el ensamblaje y la actividad de la nitrogenasa y sus cofactores metálicos en bacterias.Los genes bacterianos esenciales que deben transferirse a los cereales porque no hay proteínas endógenas correspondientes incluyen al menos nifH, nifD, nifK, nifB, nifE y nifN.Por el contrario, algunos o todos los genes accesorios, como nifU, nifS, nifQ y nifV (que proporcionan los componentes básicos de FeMo-co: grupos [Fe-S], molibdeno y homocitrato), así como nifJ y nifF ( que están involucrados en la transferencia de electrones a NifH) muestran al menos una redundancia funcional parcial con las proteínas vegetales7,38.Las contrapartes vegetales del sistema NifU/NifS se encuentran en las mitocondrias, que por lo tanto podrían proporcionar una fuente lista de grupos [Fe-S], así como la energía y el entorno casi anóxico necesario para proteger la nitrogenasa heteróloga39.Todavía no es posible transformar directamente el genoma mitocondrial de la planta, pero las proteínas codificadas por transgenes nucleares pueden dirigirse a las mitocondrias si se les proporciona el péptido de dirección N-terminal adecuado.La expresión de una proteína Fe activa en las mitocondrias vegetales requiere por lo menos nifH y nifM, y posiblemente también nifU y nifS.Cuando se produjo NifH de Klebsiella pneumoniae en E. coli, solo se requería NifM para la funcionalidad de NifH16,40, lo que sugiere que la inserción del grupo [4Fe-4S] es menos específica y puede lograrse hasta cierto punto mediante la maquinaria huésped.En la levadura, se necesitaban NifU y NifS para la provisión de grupos [Fe-S] para conferir actividad NifB41, pero no para NifH12.Esto puede reflejar los distintos mecanismos utilizados para incorporar grupos [Fe-S] en las proteínas NifB y NifH, o los diferentes requisitos para los grupos.Mientras que NifH contiene un único grupo [4Fe-4S] permanente que solo se requiere para la catálisis, NifB tiene tres grupos distintos [4Fe-4S]9.Uno es un grupo coordinado por SAM (el grupo RS) que se necesita para la actividad catalítica de NifB, y los otros dos son grupos [4Fe-4S] (grupos K1 y K2) que son los grupos de sustrato para NifB-co. formación.Por lo tanto, la expresión de NifB activo requiere una biosíntesis constante y la inserción de grupos [4Fe-4S] para reponer los utilizados para NifB-co.El huésped heterólogo también influye en la actividad de las proteínas Nif.Por ejemplo, cuando NifH se coexpresó transitoriamente con NifM, NifU y NifS en las mitocondrias de N. benthamiana, su actividad fue menor que en la levadura15.La reconstitución in vitro restableció la actividad de N. benthamiana NifH, lo que sugiere que la proteína aislada de las mitocondrias de las hojas carecía en gran medida de los grupos [4Fe-4S] necesarios.La primera proteína Fe activa reportada en plantas superiores fue NifH de A. vinelandii expresada junto con NifM en tabaco transplastómico13.Sin embargo, la proteína Fe activa solo se detectó cuando las plantas se incubaron en una atmósfera de O2 al 10 %13.Las mismas plantas transplastómicas se cultivaron posteriormente en aire normal y se detectó actividad de la proteína Fe cuando se recogieron las hojas al final del período de oscuridad y cuando se calentó el extracto de proteína23.El tratamiento térmico precipitó la proteína apo-NifH que carecía de grupos [4Fe-4S] y, por lo tanto, enriqueció la holoproteína, aumentando la actividad específica de la proteína NifH restante.El estudio sugirió que el sistema de biosíntesis de grupos [Fe-S] endógeno en los plástidos era, al igual que en las mitocondrias de N. benthamiana, insuficiente para la maduración completa de NifH23.Resultados similares fueron reportados por la expresión transitoria de A. vinelandii NifH, NifM, NifU y NifS solubles en cloroplastos de N. benthamiana14.NifHAv estuvo activo cuando las hojas se cosecharon al final del período de oscuridad, pero solo cuando se coexpresó con NifUAv y NifSAv, lo que confirma que los factores de ensamblaje y transferencia de cloroplastos no pueden proporcionar una cantidad suficiente de grupos [Fe-S] para el Montaje de un NifH14 funcional.Después de examinar 32 proteínas NifH diversas en N. benthamiana para comparar el nivel de expresión, la solubilidad y la funcionalidad, se descubrió que NifHHt tiene propiedades superiores para la expresión en plantas15.Por esta razón, aquí usamos la etiqueta TS y STAC para purificar NifHHt de plantas de arroz y callos transformados de manera estable.La proteína OsNifHHt migró como una banda principal tanto en los callos de arroz como en las plantas, lo que confirma el procesamiento correcto en las mitocondrias.La proteína OsNifHHt aislada era incolora, pero esto era de esperar dada su baja concentración en extractos de arroz en comparación con los de bacterias o levaduras.Lo que es más importante, la proteína OsNifHHt era soluble y estable en las mitocondrias de arroz, aunque no estaba completamente equipada con su grupo [4Fe-4S], y podía activarse fácilmente cuando se complementaba con NifU in vitro cargado en grupo [4Fe-4S].Esto es esencial porque la proteína Fe debe ser abundante, estable y soluble para una ingeniería de nitrogenasa exitosa en las plantas.La acumulación de una proteína NifH inestable podría inducir estrés y daño celular si se expone a O2, o si los grupos de [4Fe-4S] estuvieran limitados por otras razones.La reconstitución in vitro eficiente de la proteína OsNifHHt indicó que la investigación futura debería centrarse en mejorar el transporte de Fe, la biosíntesis de grupos [Fe-S], la entrega a las proteínas Nif y la protección.En este sentido, los intentos repetidos de coexpresar NifU y NifS de A. vinelandii no lograron generar una acumulación de proteína detectable en callos de arroz y plantas regeneradas a pesar de los altos niveles de expresión de ARNm (Figura 12 complementaria).Alternativamente, la entrega de grupos [Fe-S] a las proteínas Nif podría mejorarse mediante la manipulación de la homeostasis de Fe del huésped (usando líneas de arroz fortificadas con Fe) y las vías mitocondriales endógenas.Nuestros resultados concuerdan con los datos informados anteriormente para las hojas de N. benthamiana (expresión transitoria).El rendimiento de NbNifHHt fue de ~5–6 mg kg−1 de tejido foliar utilizando la purificación STAC, pero la actividad de la enzima aislada fue baja (máximo 25 nmol de etileno min−1 mg−1 cuando se usó NifH en una proporción de 40 veces). relación molar a NifDK).Sin embargo, NifH reconstituido por la transferencia in vitro de grupos [4Fe-4S] de NifU aumentó la actividad de NbNifHHt a 250 nmol de etileno min-1 mg-1.Aunque purificamos cantidades relativamente bajas de NifHHt de las plantas de arroz (0,25–0,5 mg kg−1) en comparación con N. benthamiana, el rendimiento del callo de arroz (~6 mg kg−1) fue similar al informado en N. benthamiana y el la actividad de la proteína del callo de arroz fue similar a la de la proteína de las hojas de N. benthamiana.Además, la actividad de OsNifHHt reconstituida fue ~9 veces mayor que la de la enzima aislada (50 frente a 450 nmol de etileno min-1 mg-1) e idéntica a NifHHt expresada en levadura, lo que probablemente refleja su actividad máxima en este ensayo con un complemento completo de [4Fe-4S].Es importante destacar que las enzimas reconstituidas y aisladas de la levadura mostraron actividades similares (~450 nmol de etileno min-1 mg-1), lo que confirma que NifHHt expresado en las mitocondrias de levadura cuenta con suficientes grupos de [Fe-S], lo cual no fue el caso. en arrozPor lo tanto, para mejorar la actividad de la nitrogenasa, será necesario caracterizar la inserción de [Fe-S] en NifH en la planta y orientar este proceso para mejorar.En resumen, hemos demostrado la expresión de NifHHt y NifMAv en los niveles de ARNm y proteína en callos de arroz transformados de forma estable y plantas regeneradas.Generamos plantas de arroz que dirigen la proteína nitrogenasa Fe a las mitocondrias.La proteína Fe purificada del arroz era estable, soluble y capaz de transferir electrones a NifDKAv, lo que confirma la incorporación de grupos endógenos mitocondriales de arroz [4Fe-4S], aunque en niveles bajos.La acumulación estable de proteína Fe en arroz transgénico, un cultivo básico importante, representa un paso crítico hacia la expresión de un complejo Nif funcional completo, como se requiere para lograr BNF en cereales, aunque es probable que los niveles de proteína Fe activa obtenidos en este estudio no sean pero suficiente para este objetivo.La investigación adicional debe centrarse en aumentar la ocupación y/o la estabilidad de los grupos de NifH [4Fe-4S], conectar NifH a la maquinaria celular de transferencia de electrones y hacer que la energía general sea más favorable para la maduración y actividad de la nitrogenasa en las mitocondrias de las plantas.Los genes de H. thermophilus nifH y A. vinelandii nifM, nifS, nifU se optimizaron por codones para S. cerevisiae utilizando la herramienta GeneOptimizer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y fueron sintetizados por Thermo Fisher Scientific como parte de Engineering Nitrogen Symbiosis para África (ENSA) proyecto.La construcción ZmUbi1 + 1sti:cox4-twinstrep-nifHHt:tNos se transfirió al vector pUC57 (GenScript, Piscataway, NJ, EE. UU.) digiriendo el vector vacío con BamHI y PstI e insertando la secuencia sintética ZmUbi1 + 1sti, luego digiriendo el vector intermedio con PstI y SphI e insertando la secuencia sintética cox4-twinstrep-nifHHt:tNOS.La construcción pOsActin:su9-nifMAv:tNos se transfirió a pUC57 digiriendo el vector vacío con ACC65I y XbaI e insertando la secuencia OsActin, luego digiriendo el vector intermedio con XbaI y SaII e insertando la secuencia sintética su9-nifMAv:tNos.La construcción ZmUbi1 + 1sti:su9-nifSAv:tADH1 se transfirió al vector pUC57 digiriendo el vector vacío con EcoRI y BamHI insertando la secuencia sintética ZmUbi1 + 1sti, luego digiriendo el vector intermedio con BamHI y HindIII e insertando el su9-nifSAv sintético: secuencia tADH1.La construcción ZmUbi1 + 1sti:su9-nifUAv:tCYC1 se transfirió al vector pUC57 digiriendo el vector vacío con EcoRI y SacI e insertando la secuencia sintética ZmUbi1 + 1sti, luego digiriendo el vector intermedio con SacI y BamHI e insertando el su9-nifUAv sintético :secuencia tCYC1.Todas las enzimas de restricción y la ligasa de ADN T4 se obtuvieron de Promega (Madison, WI, EE. UU.).Los plásmidos ligados se introdujeron en células de E. coli DH5α químicamente competentes y se seleccionaron en caldo de lisogenia (LB) suplementado con 100 µg mL−1 de ampicilina.Los insertos fueron confirmados por secuenciación Sanger (Stabvida, Caparica, Portugal).Los vectores de expresión de plantas y las secuencias de los componentes genéticos se enumeran en la Tabla complementaria 1. Los cebadores utilizados para la construcción de vectores se enumeran en la Tabla complementaria 2.proc.Academia Nacional.cienciaproc.Academia Nacional.cienciaciencia de las plantasproc.Academia Nacional.cienciaArtículo PubMed PubMed Central Google AcadémicoquímicaArtículo PubMed PubMed Central Google AcadémicocienciaquímicaNat.comúnArtículo PubMed PubMed Central Google AcadémicoArtículo PubMed PubMed Central Google Académicoet al.Biotecnología vegetal.Jiang, X. et al.comúnBiol.J. Biol.químicaJ. Bacteriol.proc.Academia Nacional.cienciaquímicaRes. transgénica.Artículo PubMed PubMed Central Google AcadémicocienciaArtículo PubMed PubMed Central Google AcadémicoFrente.Agron.Trans.J. Biol.químicaMermelada.químicaSoc.J. Biol.químicaHu, Y. et al.proc.Academia Nacional.cienciaproc.Academia Nacional.cienciaproc.Academia Nacional.cienciaReinar.Res.Letón.Reinar.Microbiol.aplicaciónReinar.Microbiol.PLoS Biol.Artículo PubMed PubMed Central Google AcadémicoControl de la fijación de nitrógeno en bacterias que se asocian a cereales.Nat.Microbiol.Nat.Rev. Microbiol.proc.Academia Nacional.cienciaTendencias Plant Sci.EUR.proc.Academia Nacional.cienciaArtículo PubMed PubMed Central Google Académicomol.Criar.proc.Academia Nacional.cienciaNat.Métodos 9, 671–675 (2012).También puede buscar este autor en PubMed Google ScholarTambién puede buscar este autor en PubMed Google ScholarTambién puede buscar este autor en PubMed Google ScholarTambién puede buscar este autor en PubMed Google ScholarTambién puede buscar este autor en PubMed Google ScholarTambién puede buscar este autor en PubMed Google ScholarTambién puede buscar este autor en PubMed Google ScholarTodos los autores revisaron y aprobaron el manuscrito.Los autores declaran no tener conflictos de intereses.Los informes de los revisores están disponibles.Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material.Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedItAl enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y Pautas de la comunidad.Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.Regístrese para recibir el boletín informativo Nature Briefing: Translational Research: las principales historias en biotecnología, descubrimiento de fármacos y productos farmacéuticos.